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Einreichung Short Paper zur Abschlussarbeit

  • von

Matrikel: 52108556
Autor: Lisa Elm, MSc
Telefon: +491776856481
E-Mail: lisa.elm2808@gmail.com

Affiliation:

Medizinische Technologin,
Institut für Pathologie am Klinikum Nürnberg mit PMU Nürnberg

Studiengang: Biomedical Sciences
Forschungsbereich: Biomedical Sciences in der Gesundheitsversorgung

Vergleich verschiedener Genpanels mittels NGS zur Detektion
von FGFR2-Genfusionen beim cholangiozellulären Karzinom

– am Ion GeneStudio™ S5 Plus-System von Thermo Fisher Scientific

Schlagwörter: NGS, FGFR2, cholangiocarcinoma, gene fusion, CCC

Einleitung

Das cholangiozelluläre Karzinom (CCC, auch: Cholangiokarzinom) ist eine bösartige Tumorerkrankung mit einer schlechten Prognose (Neumann et al., 2022). Der molekulargenetischen Diagnostik kommt hierbei eine besondere Bedeutung zu, da 10–16 % der intrahepatischen Cholangiokarzinome (iCCA) Alterationen des Fibroblast-Growth-Factor-Receptor 2 (FGFR2) aufweisen. Diese haben die permanente Aktivierung unterschiedlicher tumorwachstumsrelevanter Signalkaskaden zur Folge (Incyte Biosciences International Sàrl, 2021). Eine Besonderheit am FGFR2-Gen ist, dass etwa 10 % der Fusionen mit einem unbekanntem Translokationspartner stattfinden (Neumann et al., 2022). Die Detektion möglichst aller Genfusionen im FGFR2-Gen ist klinisch relevant, da diese pathogen sein können und seit dem Jahr 2021 eine zielgerichtete Therapie mit dem oralen FGFR2-Inhibitor Pemigatinib bei nachgewiesener Genfusionspositivität verfügbar ist. Mittels Next Generation Sequencing(NGS) können sowohl bekannte als auch unbekannte Translokationspartner im FGFR2-Gen identifiziert werden. Hierbei ist jedoch die Anwendung eines geeigneten Genpanels ausschlaggebend, da sich methodenabhängig nicht alle NGS-Methoden gleichermaßen zur Identifizierung, insbesondere unbekannter, Genfusionspartner eignen (Incyte Biosciences International Sàrl, 2021).

Das Ziel dieser Masterarbeit ist es, die Leistung und Zuverlässigkeit verschiedener Genpanels für die Detektion von FGFR2-Genfusionen zu vergleichen und zu ermitteln, welches Panel optimale Ergebnisse erzielt. Im pathologischen Institut am Klinikum Nürnberg wird zur molekularpathologischen Analyse von Formalin-fixiertem-Paraffin-eingebettetem(FFPE)-Material mit dem Oncomine™ Focus Assay (OFA) von Thermo Fisher Scientific gearbeitet. Dieses zielt hauptsächlich auf 23 Genfusionen mit bekanntem Translokationspartner ab (Thermo Fisher Scientific, o. D.-a). Die Limitierung des OFA-Panels besteht somit darin, dass die Translokationspartner bekannt sein müssen. Deshalb wird derzeit bei Anforderungen, bei denen Genfusionen von klinischer und therapeutischer Bedeutung sind, der Oncomine™ Comprehensive Assay Plus (OCA+) von Thermo Fisher Scientific für die RNA-Analyse verwendet. Laut Herstellerangaben können mit diesem ebenso unter anderem FGFR2-Fusionen ohne bekanntem Translokationspartner anhand des RNA Exon Tile Fusion Imbalance Assay bei ausreichender Abdeckung detektiert werden (Thermo Fisher Scientific, 2023). Diese Methode ermöglicht die Entdeckung neuer Fusionen und prognostiziert den Bruchpunkt der Fusion innerhalb einer Gruppe von Exonen in relevanten Treibergenen (Thermo Fisher Scientific, o. D.-b).

Im vergangenen FGFR2-Ringversuch konnten mit dem OFA keine und mit dem OCA+ lediglich drei von vier der nachzuweisenden FGFR2-Genfusionen detektiert werden, sodass es fraglich ist, ob mit dem OCA+ alle Genfusionen mit unbekanntem Translokationspartner im FGFR2-Gen aufgezeigt werden können oder ob hierfür das Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel bevorzugt werden sollte. Mit diesem kann eine größere Anzahl an Genfusionen mit unbekanntem Translokationspartner nachgewiesen werden, da mit diesem direkt ab dem Bruchpunkt mithilfe der Anchored Mulitplex PCR (AMP™)-Methode sequenziert und so der Translokationspartner direkt identifiziert werden kann (Diagnostica Longwood, o. D.). Die primäre Zielsetzung dieser Masterarbeit besteht somit in der Untersuchung, ob mittels des Archer® FusionPlex® Lung v2-Panels diejenigen FGFR2-Genfusionen identifiziert werden können, die in den FGFR2-Ringversuchsproben unter Verwendung der gegenwärtig angewandten Oncomine™ Assays nicht nachweisbar waren. Zusätzlich wird evaluiert, ob potenziell unentdeckte FGFR2-Genfusionen in Patientenproben, die in den vorangegangenen Jahren mit der Diagnose CCC befundet wurden, durch den Einsatz des Archer® FusionPlex® Lung v2-Panels nachgewiesen werden können.

Die Forschungsfrage für diese Masterarbeit lautet: Werden mit dem Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel im Vergleich zu dem OFA und dem OCA+ von Thermo Fisher Scientific eine größere Anzahl an Fusionen des FGFR2-Gens beim CCC detektiert? Aus der Forschungsfrage leitet sich folgende Hypothese ab: Mit dem OFA und dem COA+ von Thermo Fisher Scientific werden im pathologischen Institut am Klinikum Nürnberg FGFR2-Genfusionen übersehen.

Methodische Vorgehensweise

Das Probenkollektiv setzte sich aus den zehn FGFR2-Ringversuchsproben von der QUIP 2021 und 17 anonymisierte RNA-Proben von Patient:innen aus der Routinediagnostik der vergangenen drei Jahre mit der Diagnose CCC zusammen. Von den Patientenproben wurden 14 zuvor mit dem OFA und/oder dem OCA+ als Wildtypen diagnostiziert. Es wurden drei weitere Patientenproben in das Probenkollektiv aufgenommen, bei denen im Vorfeld eine KRAS-Mutation diagnostiziert wurde, da bei Patient:innen mit einer KRAS-Mutation parallel eine FGFR2-Genfusion vorliegen kann (Kendre et al., 2021).

Alle Proben wurden einer halbleiterbasierten NGS-Analyse mit dem Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel am Ion GeneStudio™ S5 Plus-System von Thermo Fisher Scientific unterzogen. Die Ergebnisse wurden mittels der Archer Analysis 7-Software ausgewertet. Für diese Masterarbeit wurde für die Patientenproben 1–8, die vor der Durchführung des FGFR2-Ringversuchs lediglich mit dem OFA befundet wurden, nachträglich ein OCA+-Ansatz zum Datenvergleich pipettiert und mittels der Ion Reporter™-Software ausgewertet. Die Sequenziergebnisse der Patientenproben sowie die Ergebnisse der FGFR2-Ringversuchsproben mit den Oncomine™ Assays wurden für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt die Gegenüberstellung der Sequenzierergebnisse des OFA, OCA+ und des Archer® FusionPlex® Lung v2-Panels hinsichtlich der Detektion von FGFR2-Genfusionen sowieso die Angabe des RNA Exon Tile Imbalance Scores für den OCA+ für alle getesteten Proben. Es wurde nach der Detektion der Wildtypsequenzen aller FGFR2-Ringversuchsproben mit dem OFA während des Ringversuchs, auch für die Routinediagnostik, auf den OCA+ umgestellt, weshalb nicht für alle Patientenproben Sequenzierergebnisse mit dem OFA vorliegen. Für alle angegebenen Ergebnisse wurden die allgemeinen und für das jeweilige Panel geltenden Qualitätskriterien erzielt sowie die internen Expressionskontrollen detektiert.

[Tabelle 1: Ergebnisse des Genpanelvergleichs von dem OFA, OCA+ und Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel und Angabe des RNA Exon Tile Fusion Imbalance Scores für den OCA+ (Quelle: eigene Darstellung)]

Bezogen auf die Proben des FGFR2-Ringversuchs konnten mit dem OFA keine der vier exprimierten FGFR2-Genfusionen detektiert werden. Mit dem OCA+ wurde eine FGFR2-BICC1- und eine FGFR2-TRIM8-Genfusion detektiert. Somit wurden zwei der vier in den FGFR2-Ringversuchsproben enthaltenen FGFR2-Genfusionen zuverlässig analysiert. Bei der FGFR2-DBP-Genfusion der FGFR2-Ringversuchsprobe 07 konnte beim OCA+ ein RNA Exon Tile Fusion Imbalance Score von 1,47 (Grenzwert für Genfusionspositivität: ≥ 1,5) in der Ion Reporter™-Software und ein p-Wert von 0,01 für den RNA Exon Fusion Tile Imbalance Score angegeben werden. Für die FGFR2-ATEE1-Genfusion der FGFR2-Ringversuchsprobe 10 wurde lediglich ein RNA Exon Tile Fusion Imbalance Score von 1,1 angegeben. In diesem Fall wurde somit fälschlicherweise eine Wildtypsequenz befundet.

Mit dem Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel wurden alle vier FGFR2-Genfusionen der FGFR2-Ringversuchsproben zuverlässig detektiert. Alle zuvor entweder mit dem OFA und/oder dem OCA+ diagnostizierten Wildtypsequenzen konnten mit dem Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel bestätigt werden.

Aus den erzielten Sequenzierergebnissen wurden die Leistungskenndaten Sensitivität und Spezifität des jeweiligen Assays für die FGFR2-Ringversuchsproben berechnet und in Tabelle 2 gegenübergestellt. Ein positives Ergebnis für den RNA Exon Tile Fusion Imbalance Score vom OCA+ wurde als Resultat mit einer fünfzigprozentigen Richtigkeit während der Berechnung interpretiert.

[Tabelle 2: Gegenüberstellung der Sensitivität und Spezifität der detektierten Sequenzierergebnisse des OFA, OCA+ und Archer® FusionPlex® Lung v2-Panels für die FGFR2-Ringversuchsproben (Quelle: eigene Darstellung)]

Diskussion

Für die Detektion von FGFR2-Genfusionen gibt es unterschiedliche Labormethoden mit verschiedenen Vor- und Nachteilen. Hierbei handelt es sich in aufsteigender Spezifität bzw. Geeignetheit um die Folgenden: Immunhistochemie (IHC), Reverse Transkriptase-Polymerasen-Kettenreaktion (RT-PCR), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und NGS (Incyte Biosciences International Sàrl, 2021). Nach Neumann et al. (2022) können weder FISH-Ansätze, die bis dato den Goldstandard für Fusionsanalysen darstellen, noch der Ungleichgewichtstest erkennen, ob ein Fusionspartner im offenen Leserahmen (In-Frame-Fusion) ist. Somit können mit der FISH weder die Expression noch die Struktur eines Fusionsproteins bewertet werden (Neumann et al., 2022). Incyte Biosiences (2021) gibt an, dass intrachromosomale Rearrangements, die etwa die Hälfte der FGFR2-Genfusionen beim iCCA ausmachen bei der FISH dazu führen können, dass Ergebnisse fälschlicherweise als negativ bewertet werden. NGS bietet eine Vielzahl von Vorteilen: Es können zahlreiche Zielgene gleichzeitig in einer einzigen Probe analysiert werden, wodurch eine effiziente und umfassende Untersuchung ermöglicht wird. Darüber hinaus weist NGS eine hohe Sensitivität und Spezifität auf. Es ist erwähnenswert, dass kommerziell verfügbare Kits, wie das Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel, speziell für den Nachweis von Genfusionen existieren. Zudem sind RNA-basierte NGS-Analysen in der Lage, transkribierte In-frame-Fusionen von Out-of-frame-Fusionen zu differenzieren. Ein weiterer Vorteil von NGS ist seine Fähigkeit, bekannte wie auch bislang unentdeckte Fusionen zu erkennen, ungeachtet der Bruchstellen oder Partnergene (Incyte Biosciences International Sàrl, 2021).

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Nachteile Amplicon-basierter NGS-Genpanels zur Ermittlung unbekannter Translokationspartner auf. Nach Neumann et al. (2022) liegt dies daran, dass diese spezifische Primer für das jeweilige Exon des beteiligten Fusionspartners im Panel-Design benötigen, um eine bestimmte FGFR2-Genusion zu erkennen. Die Anzahl der relevanten Exons aller möglichen FGFR2-Genfusionspartner ist jedoch zu groß, um in einem einzigen Amplicon-basierten Panel untergebracht zu werden. Daher sind Kompromisse erforderlich, die in einigen Fällen zu diagnostischen Mängeln führen können (Neumann et al., 2022). Der OCA+ performte in dieser Arbeit aufgrund der deutlichen größeren Anzahl an FGFR2-Primerpaaren im Gegensatz zum OFA und aufgrund des von Thermo Fisher Scientific entwickelten RNA Exon Tile Fusion Imbalance Scores besser. Der RNA Exon Tile Fusion Imbalance Score entfällt jedoch als zuverlässiges Tool für das Berichten einer FGFR2-Genfusion, unabhängig davon, dass der Translokationspartner nicht identifiziert werden kann. Der Grund hierfür ist, dass dieser in 75 % der fusions-positiven FGFR2-Ringversuchsproben in dem Ansatz für diese Masterarbeit falsch-negativ ausfiel. Mit der AMP™-Technologie von Archer®, bei der durch eine Nested-PCR mit zwei genspezifischen und einem universellen Primer jegliche Genfusionspartner identifiziert werden können, ist hingegen eine Detektion unbekannter Translokationspartner möglich.

Abschließend lässt sich feststellen, dass eine präzise Kenntnis der genomischen Architektur und des Assay-Designs für den zuverlässigen Nachweis von FGFR2-Genfusionen beim CCC von großer Bedeutung ist (QUIP,2022). Die Anzahl der potenziellen relevanten FGFR2-Genfusionspartner nimmt kontinuierlich zu und umfasst derzeit bereits mehr als 150 verschiedene Gene. Daher ist es entscheidend, einen translokationspartnerunabhängigen NGS-Ansatz zu wählen. Dies gewährleistet eine zuverlässige Identifizierung von Patient:innen mit FGFR2-Genfusionen und stellt sicher, dass diese genetisch definierte Patientengruppe von wirksamen Behandlungsstrategien nicht ausgeschlossen wird (Neumann et al., 2022; Saborowski et al., 2020).

Durch den Genpanelvergleich und die Berechnung der Leistungskenndaten Sensitivität und Spezifität konnte das Ziel dieser Masterarbeit erreicht werden: Nur das Archer® FusionPlex® Lung v2-Panel konnte aufgrund der AMP™-Technologie eine hundertprozentige Sensitivität und Spezifität erzielen, weshalb dieses zukünftig ausschließlich für die NGS-Analyse beim genfusionsrelevanten CCC zukünftig am pathologischen Institut am Klinikum Nürnberg zur Anwendung kommen wird.

Saborowski et al. (2020) geben an, dass bislang die erst kürzlich zugelassene, zielgerichtete Therapie mit Pemigatinib lediglich für die Behandlung von Patient:innen mit bereits zuvor versagter Therapie und/oder Metastasenbildung vorgesehen war. Aufgrund der ermutigenden Studiendaten zur Zweitlinientherapie läuft derzeit bereits die FIGHT-302-Studie zur Erstlinientherapie mit FGFR-Inhibitoren beim iCCA, um die Wirksamkeit von Pemigatinib als Erstlinientherapie im Vergleich zur konventionellen Chemotherapie zu bewerten (Neumann et al.,2022; Saborowski et al., 2020).

Chmiel et al. geben an, dass es trotz der vielversprechenden Studiendaten von selektiven FGFR-Inhibitoren jedoch weiteren Forschungsbedarf gibt, da erst kürzlich Studien zu Co-Mutationsspektren und die damit verbundene sekundäre Resistenzentwicklung gegen FGFR-Inhibitoren veröffentlich wurden, die zu einem Therapieversagen führen können. Die genetische Heterogenität im CCC könnte einen Einfluss auf die Resistenz gegen FGFR-Inhibitoren haben (Chmiel et al., 2022). Somit wird in Zukunft eine enge Zusammenarbeit zwischen klinischen Experten und Grundlagenwissenschaftlern von hoher Relevanz sein, um die molekularen Grundlagen des therapeutischen Versagens zu verstehen. Diese neuesten wissenschaftlichen Erkenntnisse und Studien unterstreichen einmal mehr die Bedeutsamkeit, einen geeigneten und zuverlässigen NGS-Assay zur Identifizierung sowohl bekannter als auch unbekannter Translokationspartner im FGFR2-Gen beim CCC zu verwenden.

Literatur

Chmiel, P., Gęca, K., Rawicz-Pruszyński, K., Polkowski, W. & Skórzewska, M. (2022). FGFR inhibitors in Cholangiocarcinoma—A novel yet primary approach: Where do we stand now and where to head next in targeting this axis? Cells, 11(23), 3929. https://doi.org/10.3390/cells11233929

Diagnostica Longwood. (o. D.). FusionPlex® Lung v2. dlongwood.com. Abgerufen am 9. Juni 2023, von https://www.dlongwood.com/en/products/fusionplex-lung-v2/

Incyte Biosciences International Sàrl. (2021, September). Fusionen des Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptors 2 (FGFR2) beim intrahepatischen Cholangiokarzinom (iCCA). cholangiocarcinoma-eu.com. Abgerufen am 10. Juni 2023, von https://www.cholangiocarcinoma-eu.com/pdfs/Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor%202-Fusionen%20bei%20Patienten%20mit%20intrahepatischem%20CCA.pdf

Kendre, G., Marhenke, S., Lorz, G., Becker, D., Reineke-Plaaß, T., Poth, T., Murugesan, K., Kühnel, F., Woller, N., Wirtz, R. M., Pich, A., Marquardt, J. U., Saborowski, M., Vogel, A. & Saborowski, A. (2021). The Co‐mutational Spectrum Determines the Therapeutic Response in Murine FGFR2 Fusion‐Driven Cholangiocarcinoma. Hepatology, 74(3), 1357–1370. https://doi.org/10.1002/hep.31799

Neumann, O., Burn, T., Allgäuer, M., Ball, M., Kirchner, M., Albrecht, T., Volckmar, A., Beck, S. C., Endris, V., Goldschmid, H., Lehmann, U., Seker-Cin, H., Uhrig, S., Roessler, S., Budczies, J., Fröhling, S., Longerich, T., Wagner, A. H., Vogel, A., . . . Kazdal, D. (2022). Genomic architecture of FGFR2 fusions in cholangiocarcinoma and its implication for molecular testing. British Journal of Cancer, 127(8), 1540–1549. https://doi.org/10.1038/s41416-022-01908-1

Saborowski, A., Lehmann, U. & Vogel, A. (2020). FGFR inhibitors in cholangiocarcinoma: what’s now and what’s next? Therapeutic Advances in Medical Oncology, 12, 175883592095329. https://doi.org/10.1177/1758835920953293

Thermo Fisher Scientific. (o. D.-a). Oncomine Focus Assay | Thermo Fisher Scientific – IE. thermofisher.com. Abgerufen am 9. Juni 2023, von https://www.thermofisher.com/at/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-oncology/oncomine-focus-assay.html

Thermo Fisher Scientific. (o. D.-b). Novel fusion detection using expression imbalance. thermofisher.com. Abgerufen am 16. Mai 2023, von https://ionreporter.thermofisher.com/ionreporter/help/GUID-E9625359-21E2-4BEE-935D-59652AA662A9.html

Thermo Fisher Scientific. (2023). Comprehensive genomic profiling without compromise : The Ion TorrentTMOncomineTM  Comprehensive Assay Plus. thermofisher.com. Abgerufen am 9. Juni 2023, von https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Flyers/oncomine-comprehensive-assay-plus-flyer.pdf

QUIP. (2022). Ringversuchsbericht FGFR2 Fusionen Cholangiokarzinom 2021. In quip.eu. QUIP- Qualitätssicherungsinitiative Pathologie GmbH.

Abbildungen

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Erstbeurteilung:
Zweitbeurteilung:

Anmerkung: