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Einreichung Short Paper zur Abschlussarbeit

  • von

Matrikel: 52108568
Autor: Theresa Pesch, MSc
Telefon: +41762306027
E-Mail: theresa.pesch@gmx.ch

Affiliation:

Biomedizinische Analytikerin
Institut für Veterinärpathologie der Universität Zürich
Winterthurerstrasse 268
CH-8057 Zürich

Studiengang: Biomedical Sciences
Forschungsbereich: Biomedical/Life Sciences

Validation of a Viability-PCR for the determination of replicable Chlamydia trachomatis in
rectal swabs from men who have sex with men

Establishment of this method as part of a pilot study

Schlagwörter: Chlamydia trachomatis (CT), Rektumtupfer, Männer, die Sex mit Männern haben (MSM), Viability-PCR (V-PCR)

Einleitung

Gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO) infizieren sich täglich mehr als eine Million Menschen mit Geschlechtskrankheiten, und diese Zahlen nehmen weiter zu. Dies macht sexuell übertragbare Infektionen (STIs) zu einem weltweiten Gesundheitsproblem. Die höchsten Fallzahlen bakterieller STIs werden durch Chlamydia trachomatis (CT; 129 Millionen im Jahr 2020) und Neisseria gonorrhoeae (NG; 82 Millionen im Jahr 2020) verursacht, die oft als Ko-Infektion auftreten. Beide Infektionen verlaufen meist symptomlos, können jedoch zu schwerwiegenden gesundheitlichen Problemen, einschließlich Unfruchtbarkeit, führen, wenn sie unbehandelt bleiben. Die zunehmende Resistenz gegen die meisten Antibiotika reduziert die Behandlungsoptionen von NG kontinuierlich. Daher ist die Reduzierung unnötiger Antibiotikabehandlungen ein Hauptziel der Schweizer Strategie gegen Antibiotikaresistenzen (StAR).

Der Goldstandard für die Diagnose von CT-Infektionen ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die häufig für die Untersuchung von Primärharn verwendet wird. Trotz der hohen Sensitivität und Spezifität der PCR hat diese Methode einen Nachteil: Sie kann keine Aussagen zur Viabilität und damit zur Replikationsfähigkeit von CT treffen. Die Viabilität der obligat intrazellulären CT kann bisher ausschließlich in einem zellkulturbasierten System untersucht werden. Die Isolierung von Chlamydien in diagnostischen Labors ist jedoch nicht routinemäßig durchführbar, da sie sehr aufwändig und teuer ist und spezielle Fachkenntnisse sowie Infrastruktur erfordert. Eine Möglichkeit, die hohe Sensitivität und Spezifität der PCR mit dem Nachweis der Viabilität von CT zu kombinieren, ist die Viability-PCR (V-PCR). Hierbei wird auf Grundlage der Membranintegrität der CT die doppelsträngige DNA (dsDNA) von nicht lebensfähigen CT vor der DNA-Extraktion und anschließender Analyse mittels PCR eliminiert. Dieser Ansatz kann einer Überbewertung positiver PCR-Ergebnisse für CT entgegenwirken und unnötige Antibiotikabehandlungen reduzieren.

Das Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob die V-PCR zuverlässig zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen CT unterscheiden kann. Zusätzlich wurde getestet, ob die verwendeten Tupfer bzw. deren Transportmedium sowie das humane Probenmaterial an Rektumtupfern von Männern, die Sex mit Männern haben (MSM) und das zu untersuchende Probenvolumen mögliche Einflussfaktoren für die V-PCR darstellen.

Methodische Vorgehensweise

Das Prinzip der V-PCR basiert auf dem fotoreaktiven Farbstoff PMAxx™, der an die dsDNA von CT mit beeinträchtigter Membranintegrität bindet. Alle Proben wurden in zwei Aliquots aufgeteilt, wobei eines mit PMAxx™ behandelt wurde, während das andere unbehandelt blieb und als Kontrollprobe diente. Nach Bestrahlung durch ein LED-Fotolysegerät bildeten PMAxx™ und dsDNA kovalente Bindungen, die sowohl die DNA-Extraktion als auch die Polymerase-Bindung und damit die Amplifikation der DNA verhindern. Der Unterschied zwischen der unbehandelten Probe (lebensfähige und nicht lebensfähige CT) und der PMAxx™-behandelten Probe (nur lebensfähige CT) wird als Δlog CT/ml dargestellt, der mit zunehmender CT-Viabilität in der Probe abnimmt (Abbildung 1 Eine Hälfte der Probe wird mit PMAxx™ behandelt, was bei Bakterien mit beeinträchtigter Membranintegrität zu kovalenten Bindungen mit der dsDNA während der Fotoaktivierung führt. Die andere Hälfte wird nicht vorbehandelt und dient als Kontrollprobe bei nachfolgenden Analysen.). Das Prinzip der Isolierung beinhaltet die Inokulation von adhärenten Zellen mit CT, gefolgt von der Fixierung mit Methanol nach 48 Stunden. Im Immunfluoreszenz-Assay (IFA) wurden die Einschlüsse von CT mittels Antikörper gegen die Chlamydiaceae-Familien-spezifischen Lipopolysaccharide angefärbt und an einem Fluoreszenzmikroskop gezählt – angegeben als Einschluss-bildende Einheiten (IFU).

Der Validierungsprozess der V-PCR wurde in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Teil wurden die Konzentration und Viabilität des verwendeten CT-Stamms mittels PCR und Isolation definiert. Alle Experimente wurden mit CT-Konzentrationen von 10E3 bis 10E6 IFU/ml durchgeführt, was die erwartete Bakterienlast einer Infektion bei Patienten repräsentiert. Im zweiten Schritt wurde getestet, ob das phenolrothaltige Universal Transport Medium®, das in den Proben vorkommende humane Material (Blut, Fäzes) oder die Untersuchung von nur geringem Probenvolumen einen Einfluss auf die V-PCR und deren Effizienz hat. Die Effizienz der V-PCR wurde jeweils durch die Untersuchung von CT in definierten Viabilitäts-Verhältnissen (0,1% bis 100% lebensfähige CT) ermittelt.

Ergebnisse

Die Untersuchung der Proben mit definierten Viabilitäts-Verhältnissen zeigte zum einen eine stabile CT-Konzentration (Log10 CT/ml) in allen unbehandelten Proben sowie eine, im Verhältnis zur geringer werdenden Konzentration von lebensfähigen CT stehende, Verringerung der Log10 CT/ml bei den PMAxx™-behandelten Proben (Abbildung 2 A Ergebnisse der qPCR von CT (10E6 IFU/ml) in definierten Viabilitäts-Verhältnissen von 0,1%, 1%, 10%, 50% und 100%, die nach Behandlung +/- PMAxx™ und Photolyse analysiert wurden (A). Steigende Δlog CT/ml in den Proben mit weniger lebensfähigem CT zeigt die Fähigkeit der V-PCR, viable von nicht-viablen CT zu unterscheiden (B). Verschiedene Probenvolumen (200 μl, 250 μl, 300 μl) wurden mit den Viabilitäts-Verhältnissen von 10% und 50% nach Behandlung +/- PMAxx™ und Photolyse analysiert (C). Der Anstieg der Δlog CT/ml ist vergleichbar mit den Proben grösserer Volumina (D)). Die mit PMAxx™ behandelten Proben zeigten einen Anstieg des Δlog CT/ml, abhängig von den sinkenden Viabilitäts-Verhältnissen, was die Fähigkeit der V-PCR zeigt, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen CT zu unterscheiden (Abbildung 2 B). Es konnte kein Einfluss von Phenolrot-haltigem Medium gemessen werden, was die Robustheit der V-PCR gegenüber dem Medium zeigt. Ein Effekt von humanem Material auf die Trübung der Probe und damit auf die Bildung der kovalenten Bindungen zwischen dsDNA und PMAxx™ konnte nicht beobachtet werden. Die Messungen der unterschiedlichen Probenvolumina (200 µl, 250 µl, 300 µl, 400 µl) ergaben nur geringfügige Abweichungen in den berechneten Δlog CT/ml in den Viabilitäts-Verhältnissen von 10% und 50% (Abbildung 2 C, D).

Diskussion

Die V-PCR wurde an unserem Institut validiert, da sich bereits veröffentlichte Protokolle, z.B. von Janssen et al. (Referenz), hinsichtlich der Material- und Methodenbedingungen sowie des Probentyps unterscheiden. Das Ziel des ersten Teils im Validierungsprozess war es, mögliche Einflussfaktoren von Medium-Komponenten und von in Rektumtupfern enthaltenem humanem Material zu definieren. Der Vergleich zwischen einem Phenolrot-freien und dem Phenolrot-haltigem Medium ergab keinen Unterschied, wodurch ein Einfluss von Medium-Komponenten bzw. eine Interaktion mit den fotosensitiven Reagenzien der V-PCR ausgeschlossen werden konnte. In den untersuchten Proben konnte kein Einfluss von humanem Material festgestellt werden. Die Ergebnisse zeigen nur geringfügige Abweichungen zwischen den CT-Konzentrationen in reinem Medium versus Medium, welches humanes Material enthielt. Inhibitionen und Effekte durch die Trübung der Probe auf die LED-Fotolyse der V-PCR konnten ausgeschlossen werden. Es konnte keine Publikation gefunden werden, die diese Einflussfaktoren untersucht hat; daher kann dieser erste Teil nicht in Bezug auf vorhergehende Veröffentlichungen diskutiert werden. Der zweite Teil des Validierungsprozesses galt der technischen Validierung, der Unterscheidung von lebensfähigen und nicht lebensfähigen CT nach Vorbehandlung mit bzw. ohne PMAxx™ sowie der Analyse des Effekts von verschiedenen Probenvolumina auf die V-PCR. Die mit PMAxx™ behandelten Proben zeigten ein steigendes Δlog CT/ml bei sinkenden Viabilitäts-Verhältnissen (100%: 0,35, 50%: 0,86, 10%: 1,59, 1%: 2,52 und 0,1%: 3,19). Die analysierten Δlog CT/ml sind vergleichbar mit den Daten der technischen Validierung von Janssen et al. (Referenz). Die unterschiedlichen Probenvolumina zeigten nur geringfügige Unterschiede in den PMAxx™-behandelten Proben und waren vergleichbar zu den zuvor gemessenen Werten (50%: 0,82, 10%: 1,53). Es konnte keine Publikation gefunden werden, die Daten zu Volumentests für die V-PCR liefert; daher kann dieser Teil nicht in Bezug auf vorhergehende Veröffentlichungen diskutiert werden.

Im nächsten Schritt wurde die V-PCR im Rahmen einer laufenden Pilotstudie, an Rektumtupfern von Männern, die Sex mit Männern haben, etabliert. Darauf wird hier aus Gründen des Umfangs nicht weiter eingegangen.

Literatur

Biotium. (2023, 10. Februar). PMAXX™ Dye, 20 mM in H2O – biotium. https://biotium.com/product/pmaxx-20-mm-in-h2o/

COPAN Diagnostics Inc. (2023, 5. September). UTM Viral Transport | COPAN Diagnostics Inc. https://www.copanusa.com/sample-collection-transport-processing/utm-viral-transport/

FOPH. “Meldepflichtige Infektionskrankheiten – Wöchentliche Fallzahlen.” https://www.bag.admin.ch/bag/de/home/zahlen-und-statistiken/zahlen-zu-infektionskrankheiten/meldepflichtige-infektionskrankheiten—woechentliche-fallzahlen.html.

Forward K. R. (2010). Risk of coinfection with Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Nova Scotia. The Canadian journal of infectious diseases & medical microbiology = Journal canadien des maladies infectieuses et de la microbiologie medicale, 21(2), e84–e86. https://doi.org/10.1155/2010/760218

Janssen, K., Hoebe, C. J. P. A., Dukers-Muijrers, N. H. T. M., Eppings, L., Lucchesi, M. & Wolffs, P. (2016). Viability-PCR shows that NAAT detects a high proportion of DNA from Non-Viable Chlamydia trachomatis. PLOS ONE, 11(11), e0165920. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165920

Meyer, Thomas. 2016. “Diagnostic Procedures to Detect Chlamydia Trachomatis Infections.” Microorganisms 4

StAR. “Swiss Strategy on Antibiotic Resistance (StAR).” https://www.star.admin.ch/star/en/home/star/strategie-star.html (June 17, 2023).

Wanninger, S., Donati, M., Di Francesco, A., Hässig, M., Hoffmann, K., Seth-Smith, H. M., Marti, H., & Borel, N. (2016). Selective Pressure Promotes Tetracycline Resistance of Chlamydia Suis in Fattening Pigs. PloS one, 11(11), e0166917. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166917

World Health Organization: WHO. (2023, 10. Juli). Sexually transmitted infections (STIs). https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/sexually-transmitted-infections-(stis)

Abbildungen

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Erstbeurteilung:
Zweitbeurteilung:

Anmerkung: